San Juan de Ávila nació el 6 de enero de 1499 (o 1500) en Almodóvar del Campo (Ciudad Real), de una familia profundamente cristiana. Sus padres, Alfonso de Ávila (de ascendencia israelita) y Catalina Jijón, poseían unas minas de plata en Sierra Morena, y supieron dar al niño una formación cristiana de sacrificio y amor al prójimo. Son conocidas las escenas de entregar su sayo nuevo a un niño pobre, sus prolongados ratos de oración, sus sacrificios, su devoción eucarística y mariana.
Probablemente en 1513 comenzó a estudiar leyes en Salamanca, de donde volvería después de cuatro años para llevar una vida retirada en Almodóvar. A pesar de llamarlas ‘leyes negras’ los estudios de Salamanca dejaron huella en su formación eclesiástica, como puede constatarse en sus escritos de reforma. Esta nueva etapa en Almodóvar, en casa de sus padres, viviendo una vida de oración y penitencia, durará hasta 1520. Pues aconsejado por un religioso franciscano, marchará a estudiar artes y teología a Alcalá de Henares (1520-1526). De esta etapa en Alcalá existen testimonios de su gran valía intelectual, como así lo atestigua el Mtro. Domingo de Soto. Allí estuvo en o con las grandes corrientes de reforma del momento. Conoció el erasmismo, las diversas escuelas teológicas y filosóficas y la preocupación por el conocimiento de las Sagradas Escrituras y los Padres de la Iglesia. También trabó amistad con quienes habían de ser grandes reformadores de la vida cristiana, como don Pedro Guerrero, futuro arzobispo de Granada, y posiblemente también con el venerable Fernando de Contreras. Incluso pudo haber conocido allí al P. Francisco de Osuna y a San Ignacio de Loyola.